Лондон, 1897 год. Девочка-мышка, у которой похитили отца-изобретателя, встречается с великим мышиным сыщиком Бэзилом (Basil), проживающим в доме Шерлока Холмса. В поисках отца им помогает отставной военный врач Дэвид Доусон (Dr. David Q. Dawson). При ближайшем рассмотрении дела оказывается, что похититель, гений преступного мира — крыса Рэтигэн (Ratigan) — планирует захватить мышиный королевский трон.
Бэзил с Бейкер-Стрит — главный герой мультфильма, знаменитый мышинный сыщик. Его образ основан на вымышленном сыщике Шерлоке Холмсе. На протяжение развития всей сюжетной линии его основные задачи заключаются в поимке профессора Рэтигана, спасение отца Оливии, Хирама Флавершэма, а так же в предотвращение убийства мышинной королевы Виктории.
Доктор Дэвид К. Доусон — мышь-хирург, ранее служил в шестьдесят шестом королевском полку в Афганистане. Основан на докторе Джоне Х. Уотсоне из историй о Шерлоке Холмсе. Доусона восхищают методы раскрытия преступлений созданные Бэзилом и активно им же практикуемые. В конце концов он становится лучшим другом и личным биографом гениального детектива. В фильме аниматоры смоделировали характер Доусона лишь после создания его облика и внешнего вида.
Профессор Парадик Рэтиган — заклятый враг Бэзила. Его образ основан на образе профессора Джеймса Мориарти из записок о Шерлоке Холмсе. Рэтиган стремится захватить контроль над британской мышинной монархией. В конце фильма, после ожесточенного боя с Бэзилом, он падает с Биг Бена и погибает. Этот эпизод создан по аналогии с одним из рассказов о Шерлоке Холмсе имеющим название — "Последнее дело".
Оливия Флавершэм- маленькая мышка шотландского происхождения, которая обращается к Бэзилу с просьбой разыскать её похищенного отца.
Фиджет- летучая мышь. Сподручник Рэтигана. Делает всю грязную работу за своего босса. Фиджед-калека. Вместо одной ноги у него деревянный костыль, а левое крыло сломано вследствие чего он не может летать. В конце фильма Рэтиган бросает Фиджета из летающей машины в Темзу. Установлено, (хотя в книге, а не в кино), что он пережил падение (как не объясняется). Возможно, он погибает в фильме.
Хирам Флэвершем- любящий отец Оливии. Лучший мастер в своем деле по изготовлению заводных игрушек. В начале фильма его похищает Фиджет, для того чтобы Хирам создал, так необходимую для воплощения в жизнь коварных планов Рэтигана, механическую копию Мышиной королевы Виктории. Хирам пытается сопротивляться, но Рэтигам начинает шантажировать его жизнью дочери, и он вынужден подчинятся указаниям коварного профессора.
Мышиная королева Виктория- мышиная королева Англии, чей трон и пытается занять Рэтиган. Она является пародией на королеву Викторию и по фильму её юбилей совпадает с юбилеем реальной Виктории(что можно понять по украшениям Букингемского дворца).
г-жа Джадсон- экономка Бэзила. Она обожает его, но бывает очень раздражена, когда он плохо обращается с её лучшими подушками, стреляя по ним из пистолет. г-жа Джадсон основана на г-же Хадсон .
Тоби- выдрессированный Бэзилом Бассет-хаунд, принадлежаший Шерлоку Холмсу, который по сюжету живёт этажом выже своего мышиного прототипа.
Фелиция- массивная кошка. Любимица Рэтигана. Он подзывает её звоном колокольчика для расправы над его врагами и предателями. Обычно Фелиция съедает их.
Бартоламью-Один из приспешников Рэтигана. В начале фильма, во время песни Рэтигана, порядком пьяный Бартоламью называет своего босса крысой; в ярости, Рэтиган бросает его на улицу и призывает Фелицию, которая съедает опъяневшего воришку.